| 초록 |
□ 연구의 목적 및 내용 본 연구과제는 CRISPR/Cas 시스템을 기반으로 하는 게놈에디팅 기술을 활용하고, 이를 바이오에너지 생산 균주에 적용하여 효율적인 균주개량에 응용하는 것을 목표로 함. CRISPR Cas9을 작동시키기 위한 플라스미드와 프로토콜을 구축하고, 상동재조합과 빗상동말단접합을 활용한 게놈 수준의 목적진화 방법을 구현하고자 함. 이는 타이로신 생산균주에 적용되어 효율적인 목적진화를 확인하고자 하며 최근 각광받고 있는 바이오부탄올 생산균주 개발에 적용하여 높은 효율을 지닌 안정적인 바이오 에너지 생산균주를 제작하고자 함. □ 연구결과 본 연구에서는 CRISPR/Cas 시스템을 효율적으로 적용하기 위한 플라스미드를 구축하였으며, 이를 활용하여 E. coli, E. aerogenes를 포함한 다양한 균주에서 해당시스템이 작동하는 것을 확인함. crRNA와 tracrRNA가 포함된 pZS CRISPR 플라스미드와 cas9이 포함된 pCas9을 이용하여 CRISPR/Cas 시스템을 구동함. 또한 게놈편집 후 추가 게놈편집의 용이성을 위해 Bacillus subtilis 유래의 sacB를 클로닝하여 sucrose 환경에서 플라스미드의 제거를 용이하게 함. 이를 활용하여 유전자의 제거 및 삽입, point mutation을 도입 한 결과를 얻음. 또한 nuclease activity가 비활성화 된 dCas9 기술과 리보스위치를 통한 N-acetylglucosamine 생산 스크리닝 기술을 활용하여 효모의 해당과정을 조절하였고, N-acetylglucosamine의 생산성을 증대시킨 결과를 얻음. 호기조건에서 바이오 부탄올 생산성을 높이기 위해, TCA 회로의 주요 효소인 citrate synthase의 발현을 조절하고자 했으며, 리보좀 결합 부위의 염기서열을 다변화하여 세포내의 acetyl-CoA pool을 확보하고 최적의 바이오부탄올 생산균주를 개발한 바 있음. □ 연구결과의 활용계획 본 연구에서 확인한 CRISPR/Cas9을 이용한 효율적인 게놈편집 기술을 더 확장하여 호스트 균주에 외부 대사회로를 자유롭게 도입하여 artificial synthetic pathway를 구축할 수 있을 것으로 보임. 또한 세포 내의 발현량을 정교하게 조절하는 실험에도 CRISPR/Cas9 기술을 사용할 수 있을 것으로 보이며, 후속연구로 미생물의 전자전달계를 engineering 하는 실험을 계획 및 추진할 예정임. 미생물의 전자전달계는 막 단밸질로 구성이 되어있으며 막 단백질의 경우, 단순 낙아웃, 과발현이 아닌 정교한 발현량 조절이 이루어져야 미생물의 생장에 악영향을 미치지 않을 것으로 예상됨. 따라서 CRISPR/Cas9 시스템을 적용하여 미생물의 전자저달계를 조절하고 효율적인 바이오화합물 생산균주를 개발할 예정임. (출처 : 한글요약문 4p) |
