| 초록 |
□ 핵심기술 뮤코닉산 합성을 위한 새로운 유전자를 발굴하여 산업화에 적합한 생산 안정성을 갖춘 세계 최고 수준의 고생산성 뮤코닉산 생산균주 및 생산공정의 개발 □ 최종목표 E.coli와 함께 고생산성 아로마틱 아미노산 생산균주인 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum)에 대하여 바이오매스 유래의 발효당을 이용하여 TPA 전구체인 뮤코닉산(cis,cis-muconic acid)을 대량으로 생산할 수 있는 재조합균주를 제작·개량하고, 비교평가를 통하여 최종 뮤코닉산 생산균주를 선발하여, 이 균주에 적합한 최적발효·분리공정 기술을 개발하고자 함. □ 개발내용 및 결과 1. E.coli 균주 개발의 내용 및 결과 - DHS 생합성과 경쟁 관계에 있는 유전자 제거를 통하여 DHS 생산이 증대된 생산균주 개발 : DHS 81 g/L 뮤코닉산 전구체인 DHS의 생산 증대를 위해 DHS 생합성과 경쟁 관계에 있는 유전자 등 제거할 유전자 대상 선정을 위하여 glucose로부터 aromatic amino acid의 생합성 경로 분석을 통해 aroE, ptsG, tyrR, pykA 그리고 pykF 유전자를 순차적으로 제거하여 각각의 결손균주를 제작함. 5L 발효기 배양 결과, DHS 생산성은 △aroE△tyrR 결손 균주에서 최대 41 g/L, △aroE△tyrR△ptsG 결손 균주에서 최대 74 g/L, △aroE△tyrR△ptsG△pykA 결손 균주에서 최대 81 g/L, △aroE△tyrR△ptsG△pykA△pykF 결손 균주에서 최대 74 g/L의 생산성을 나타냄. 경쟁 관계의 유전자가 결손 될수록 최종산물인 DHS의 생산성이 향상되는 것을 확인 할수 있었으며, pykA까지 결손된 균주에 있어서 최대 DHS 생산성 결과를 얻음. - 뮤코닉산 생합성 외래유전자가 도입 및 promoter 최적 E.coli 균주 개발 : 뮤코닉산 51 g/L E.coli AB2834 유래 DHS 생합성과 경쟁 관계 유전자 제거 변이균주에 뮤코닉산 생산 aroZ, aroY, catA 외래유전자 도입 균주 개발에 있어서 최적의 오페론 시스템을 구축하고 동시에 뮤코닉산 생산성 향상을 위하여 lac promoter 외에 새로운 promoter개발 전략을 통해 oppA 및 fusA promoter를 확보하여 Lac promoter 보다 생산성이 10% 향상된 결과를 얻음. 이를 통하여 5L 발효기 배양 결과 뮤코닉산 51g/L의 생산성 결과를 얻음. - DHS 생합성 경로상에 있는 유전자의 발현 강화를 통한 DHS 생산 증대 변이균주 개발 및 뮤코닉산 생산 증대 : DHS 120 g/L, 뮤코닉산 64.5 g/L DHS 생합성 경로 상의 aroGFBD 유전자 및 glucose transporter 유전자 galP, ppsA를 chromosome 내로 integration 시켜 유전자를 과발현 하여 줌으로써, DHS 생합성 경로의 흐름을 더 빠르고 원활하게 하여 결과적으로 5L 발효기에서 DHS 120g/L 및 뮤코닉산 64.5g/L로 생산성이 매우 향상된 균주를 확보함. E. coli AB2834 ΔERGA ΔlacI :: Plac_galP_ppsA_Plac_aroG_aroF_ Plac_aroBD /PoppA asbF aroY catA - 안정적인 뮤코닉산 생산을 위한 뮤코닉산 생합성 외래유전자의 chromosome 내 도입을 위한 최적화 및 안정화된 균주를 확보하기 위한 다양한 시도를 수행. 2. E.coli 에서의 뮤코닉산 생산 배양공정 최적화 및 scale up - 5L 발효기에서의 배양공정 최적화 : DHS 120 g/L, 뮤코닉산 64.5 g/L 외래유전자 발현 최적화를 위하여 성장배지 및 생산배지의 최적화와 함께 glucose feeding의 적용 시점(induction point), 농도, 공급 속도 등의 다양한 변수의 최적화를 수행. 특히 feeding medium의 배지 최적화 및 공급 전략의 최적화를 통해 DHS 120 g/L, 뮤코닉산 64.5 g/L 결과 확보. Miniature system 구축을 통해 제작되는 균주의 생리활성 특성을 신속하게 파악. 통계학적 배지 최적화 프로그램을 활용하여 대사산물의 생산을 향상시킬 수 있는 최적배지 screening system을 구축함. - 뮤코닉산 생산 재조합대장균 균주의 50L, 500L 발효기에서의 배양공정 Scale-up : 뮤코닉산 60 g/L 달성 E. coli AB2834△aroE△tyrR△ptsG△pykA/fusA 균주의 50 L 발효기에서의 뮤코닉산 47 g/L 생산성 확인 E. coli AB2834△aroE△tyrR△ptsG△pykA/△LacI::PLac-galP, ppsA, aroGFBD / oppA 균주의 경우 반복 실험에서 생산 재현성 확인함 E. coli AB2834△aroE△tyrR△ptsG△pykA/fusA 균주의 500 L 발효기에서의 뮤코닉산 60 g/L 생산성 확인 3. C. glutamicum 에서의 뮤코닉산 고생산 균주 개발 - 뮤코닉산 중간대사체 축적 유도를 위한 중간대사체 및 뮤코닉산 분해대사 관련 유전자 제거 aroE gene disruption을 통한 DHS 축적 유도 균주 제작, pcaG 및 pcaH gene disruption을 통한 PCA 축적 유도 균주 제작, 그리고 catB gene disruption을 통한 뮤코닉산의 분해대사 차단을 통해 뮤코닉산 축적이 가능해진 균주 제작 C. glutamicum 13032△aroE△pcaGH△catB - 뮤코닉산 생합성을 유도할 수 있는 새로운 PCA decarboxylase 외래유전자 도입 뮤코닉산 생합성이 가능한 PCA decarboxylase 외래유전자 발굴과 함께 PCA decarboxylase 외래유전자 발현을 위한 벡터 시스템 구축, 외래유전자 발현을 위한 새로운 발현벡터의 제작을 통해 PCA decarboxylase subunit 유전자를 도입한 균주 확보. C.glutamicum ATCC13032 △aroE△pcaGH△catB /pSK002_Psod_YBDOPT1 - 뮤코닉산 생합성 경로상에 있는 유전자의 발현 강화를 통한 뮤코닉산 생합성 경로 강화 균주 개발 [인하대 전략] DHS dehydratase 활성 증가를 위한 qsuB 및 유사 유전자의 추가 도입 PCA 생합성 경로상에 있는 aroG, aroF, aroB 유전자의 발현 강화 뮤코닉산 전구물질로의 PEP와 E4P의 축적을 위한 경로 최적화 DHS의 생산량 증대를 위한 새로운 전략 : tyrR like 유전자 탐색 및 제거 - Glucose 흡수속도 개선과 연계한 뮤코닉산 생합성 경로 강화 균주 개발 [생기원 전략] 4. C.glutamicum 에서의 뮤코닉산 생산 배양공정 최적화 및 scale up - C.glutamicum ATCC13032 △aroE△pcaGH△catB /pSK002_Psod_YBDOPT1 균주의 배지 최적화 : Flask 배양에서 뮤코닉산 4 g/L : OFAT, One factor at a time에 의한 탄소원 및 질소원 조사 : Flask에서의 질소원 조합 조사 : FFD(Full Factorial Design)를 통한 생산배지 최적화 : SAM(Steepest Ascent Method)을 통한 생산배지 최적화 : 5L 발효기에서 탄소원과 질소원 비율(C/N ratio) 조사 - 5L 발효기에서의 회분식 배양공정 최적화 : 뮤코닉산 13 g/L : 성장배지 최적화, 접종량에 따른 최적화 실험(1%, 5%, 10%) - 5L 발효기에서의 회분식 배양공정 최적화 : 뮤코닉산 40 g/L : Phosphate limited fed batch : Ammonium sulfate, (NH4)2SO4 농도에 따른 조사 (1x, 1.4x, 1.8x) - 50L 발효기에서의 유가식 배양공정 Scale-up : 뮤코닉산 60 g/L - 500L 발효기에서의 유가식 배양공정 Scale-up : 뮤코닉산 62 g/L - 5000L 발효기에서의 유가식 배양공정 Scale-up : 뮤코닉산 61 g/L 5. C.glutamicum 에서의 뮤코닉산 생산 연속배양공정 개발 - SLP 공급배지의 무기 질소원조성 변화, 배양온도(30℃) 조절을 통한 연속배양공정에서의 SLP 공급배지의 농축 농도 및 빠른 희석속도는 Wash-out에 대한 위험성이 크고, 세포회수기에서 세포가 농축 |
