| 초록 |
□ 핵심기술 작물보호(유도저항성 등)와 살선충 기능을 지닌 대사물질을 고생산하는 균주, 대량배양 생산기술 및 작물 적용기술. □ 최종목표 프로바이오틱 농업미생물 대사체 기반 천연물 친환경 유기농 농자재 3개 이상 개발 (TRL : [시작] 3단계 ~ [종료] 7단계) - 프로바이오틱 농업미생물 대사체 기반 탄저병 방제용 천연물 살균제 개발 - 프로바이오틱 농업미생물 대사체 기반 천연물 살선충제 개발 - 프로바이오틱 농업미생물 대사체 기반 세균병 및 곰팡이병 방제용 천연물 살균제 개발 □ 개발내용 및 결과 1. Streptomyces sp. AG-P 균주가 생산하는 paromomycin을 이용한 작물보호제 개발 1) 활성물질 생산성 증진을 위한 균주선발 및 개량 - NTG 처리, UV 및 γ-ray 조사방법을 이용하여 paromomycin 생산성이 모균주대비 60배 증가한 고생산 변이주 M19-1 선발 2) 활성물질 고생산 균주의 생산성 및 안정성 분석/평가 - 균주안정화 및 자가내성증강실험을 통해 paromomycin 생산의 안정성 및 재현성 확인및 0.7g/L 생산성 확보 3) 활성물질 생산 극대화를 위한 배지최적화 기술개발 - 탄소원 및 질소원 최적화로서 경제성을 고려하여 Glucose, Corn starch, Soybean meal 선정 - C/N ratio 분석결과 Glucose는 5%, Corn starch는 2.5%, Soybean meal 3.5%를 최적 C/N조건으로 선정 - 파로모마이신 생산성 증진 미량원소로 MnSO 4 , MnCl 2 , Glutamic acid, Glutamine 선정 - 파로모마이신 생산 최적배지로 경제성을 고려하여 Glucose 5%, Corn starch 2.5%, Soybean meal 3.5%, MnSO 4 10mM, Glutamine 30mM 선정 4) 활성물질 대량생산을 위한 배양 기술 개발 - 5 L, 50 L, 300L, 500L 발효조 배양조건 수립 및 1.0 g/L 생산성 확보 5) 산업규모 수준 활성물질 분리정제 기술 개발 - 원료단가가 기존 resin에 비해1/150 정도 저렴한 DIAIONWK601 resin을 사용한 분리정제기술 개발 - 독성시험을 위한 원제 제작 및 주관기관에 제공 - 현장 적용시험을 위한 원제제작 및 제공 6) 활성물질 생합성 경로 연구 및 유전체 분석 - paromomycin 생산 균주 Streptomyces sp. AG-P1441 균주의 genome 분석 : genome size 9.63Mb, GC 함량 71.8% 7) 활성물질에 대한 고추 무름병, 역병, 탄저병, 배추 무름병,포도 흰얼룩병, 호박 흰가루병, 인삼 탄저병, 잿빛 곰팡이병 등에 효과를 확인하였다. 8) “흙이랑뿌리랑플러스” 제품 출시 - 활성물질을 이용한 살균제제 개발 및 제형 완료 - 식물병 발생 농가 및 자체 농장에 대한 Filed test 및 방제 프로그램 적용 개발 - 개발제품의 목록공시 등록을 위한 공인기관 시험 완료 - 개발제품의 목록공시 등록 완료 2. Paenibacillus polymyxa 균주가 생산하는 fusaricidin을 이용한 작물보호제 개발 1) 푸자리시딘 고생산 패니바실러스 균주(P. polymyxa EFP10)제작 완료 - 푸자리시딘 생합성 유전자를 제외한 5종의 불필요한 항생물질 유전자 불활성화를 통해 생산을 차단하여 푸자리시딘 생산효율을 15% 이상 제고 - 균주 제작과정에 불가피하게 사용된 항생제 내성 유전자를 모두 제거하여 안전성을 제고 - 개발균주의 유전체 염기서열 해독 및 모균과의 비교분석을 통해 외래 DNA의 잔존이 없음을 확인 - 균주 제작과정에서 포자형성능을 상실하여 자연환경에서의 생존력이 매우 약해짐에 따라 균주의 안전성이 제고 2) 개발균주(P. polymyxa EFP10)를 이용하여 푸자리시딘 대량생산 기술 개발 - 산업규모 대량배양용 배지 조성 - 500 L 배양기를 이용한 배양시험을 반복 수행하여 배양조건을 수립 - 목표치를 상회하는 2.0 g/L 생산성 확보 3) 5 ton 규모 발효조를 이용한 생산시험 완료 - 5000 L 배양기를 이용한 배양시험(working volume = 1500L)을 수행하여 성공적으로 완료 4) 여러 환경조건 하에서의 시험을 통해 푸자리시딘 배양액 및 정제된 푸자리시딘의 장기 보존 시 안정성 확보 - 25~60℃, 60일 보존 시 안정성 확인 - 42 ℃, 150일 보존 시 안정성 확인 - 80~100℃ 열처리 조건에서 안정함을 확인 5) 시제품 내에 함유된 Fusaricidin 함량분석 방법 수립 - 시제품으로부터 분석시료를 제조하는 방법을 수립함 - LC/MS 분석에 의한 정량법을 수립 6) 활성물질에 대한 고추 무름병, 역병, 탄저병, 배추 무름병, 포도 흰얼룩병, 호박 흰가루병, 인삼 탄저병, 잿빛 곰팡이병 등에 효과를 확인하였다. 7) “균잡아” 제품 출시 - 활성물질을 이용한 살균제제 개발 및 제형 완료 - 식물병 발생 농가 및 자체 농장에 대한 Filed test 및 방제 프로그램 적용 개발 - 개발제품의 목록공시 등록을 위한 공인기관 시험 완료 - 개발제품의 목록공시 등록 완료 3. 살선충물질 - 전국 각지에서 채집한 곤충병원성선충으로부터 공생세균을 분리하고, 이를 이용하여 뿌리혹선충 및 기타 식물기생선충에 대한 살선충활성을 검증하여 SCG, GD, SFF등 3개의 공생세균 후보군을 선발하였고, 선발된 공생세균의 배지조건 확립, jar fermenter를 이용한 대량배양조건 확립등 균주 생육조건 최적화를 함. - 경북 성주군 참외농가에서 채집한 뿌리혹선충을 실험실에서 토마토를 기주식물로하여 누대사육에 성공함으로써, 지속적인 살선충 실험이 가능한 조건을 확립 함 - 최적 배양 조건에서 배양된 공생세균의 배양액을 여러 조건으로 추출하여 살선충 활성을 검정하여본 결과 Cell추출물과 Broth 추출물 모두 살선충 활성이 있는 것을 확인하였으며,특히 Broth 추출물 중 에틸아세테이트 추출물이 활성이 가장 후수한 것으로 나타났으며, pH 조건에서는 매우 안전한 물질인 것으로 판단 됨. - 추출물을 최종적으로 녹일 때 사용되는 MeOH와 DMSO는 선충에 영향이 없는 것으로 나타났음 - 배양액의 생리활성 검증 결과 항산화효과, 세포보호효과, 항암효과에서 모두 우수한 효과를 나타내어 살선충 외 다른 영역으로의 확대 적용 가능성을 확인 함. - 전국 각지에서 채집한 곤충병원성선충으로부터 공생세균을 분리하고, 이를 이용하여 뿌리혹선충 및 기타 식물기생선충에 대한 살선충활성을 검증하여 SCG, GD, SFF 등 3개의 공생세균후보군을 선발하였고, 16S rRNA 유전자 염기서열에 기초한 분자계통학적 분석을 통한 동정 완료함 - 뿌리혹선충 종별 특성 비교 조사 함. - 균배양액을 centrifugation (10,000 rpm, 10 min)하여 broth 층과 mycelium cake 층으로 분리하였고, broth 층을 극성과 비극성 용매 조건에 따른 여러 가지 용매로 분획 하여 얻어진 추출물을 bioassay하여 항선충 활성이 있는 분획을 확인함. - 그 결과 Ethyl acetate 층(4.72 g)에서 활성을 보였으며 이 sample을 silica-gel TLC를 이용하여 물질에 대한 특성을 규명하였으며, silica gel column chromatography를 이용하여 step-wise gradient로 분리함. - 그 결과를 바탕으로 강력한 활성을 나타내는 CHCl3 : MeOH = 10:1의 fraction으로 high performance liquid chromatography (HPLC) 단계를 거쳐 활성물질을 분리, 정제함, 이를 Eco-1으로 명명함. - Eco-1의 화학구조를 결정하기 위해 1H-NMR, 13C-NMR, HMQC, HMBC spectrum의 분석을 통해서 구조를 assign해 본 결과, 최종 분리된 Eco-1의 화학구조를 동정함 - 공생균배양액을 centrifugation (8,000 rpm, 15 min)하여 broth 층과 mycelium cake 층으로 분리하였고, mycelium cake 층을 극성과 비극성 용매 조건에 따른 여러 가지 용매로 분획하여 얻어진 추출물을 bioassay하여 항선충 활성이 있는 분획을 확인함. - 그 결과 Hexane 층에서 활성을 보였으며 이 sample을 silica-g |
