| 초록 |
전세포 (whole-cell patch clamp) 기록에서 두 이온통로의 상호작용 (약리학적 검증) 본 연구진이 확보하고 있는 이온통로가 형질변환되어 있는 세포주들을 이용하여 ANO1, SK4 이온통로의 활성이 측정되는 것을 검증 하였다. 이어서, 두경부암세포에서 ANO1 current를 기록하였다. 그러나 이 과정에서 예상치 못한 결과에 직면하게 되었다. 처음에는 ANO1 current로 보이는 outward-rectifying 하는 current가 느리게 나타나기 시작하였으나, 10-15분 후에는 다시 사라지는 현상(run-down)이 계속 관찰되었다. 약하게 outward rectifying 하는이 전류는, 세포외 관류액의 오스몰농도를 높이면 감소하였다. 나아가, 관류액과 피펫내액의 오스몰 농도의 차이가 비교적 큰 조건으로 전세포 팻취클램프를 시행할 때 이와같은 current는 완전히 사라지는 것을 관찰하였다. 이를 근거로 본 연구진은 위에서 관찰한 current가 ANO1이 아닌 volume-regulated anion current (VRAC) 이라는 것을 결론 지었다. VRAC을 ANO1으로 오해하였던 이유는 IV-curve 형태가 비슷하였기 때문으로 사료된다. 실험 조건을 재 설정하여 VRAC current 를 억제한 뒤, ANO1 과 SK4의 상관관계를 검증하였다. OSC-19 세포주에서 SK4 current의 약리학적 제제처리시 ANO1 current와 ANO1을 억제 하였을 때 SK4의 current를 측정한 결과 변화가 없었다. 이는 약리학적 제제를 처리하였을 때 SK4와 ANO1의 상호작용을 검증할 수 없다는 것을 의미한다. 두경부암 세포주에서 ANO1의 비활성 상태 관찰 및 가설 검증 본 연구진은 지금까지 알려진 것과 다른 특이한 현상을 관찰 할 수 있었다. VRAC current를 억제 하였을 때, 남아있는 anion current가 관찰 되지 않았다. 이 문제에 대한 답을 얻기 위하여 우선, 다른 종류의 암세포들을 비교하였지만 current가 관찰 되었다. 일반적으로 암세포주는 산발적인 돌연변이를 동반하고 있는 경우가 많기 때문에, 본 연구진은 먼저 대상 세포주에서 ANO1이 돌변변이가 있는지 염기서열 sequencing을 통하여 알아보았다. 그러나 기능에 영향을 주진 않는 ANO1 variant가 발견되지만 이것은 current가 기록되지 않는 것을 설명할 수 없었다. 다른 가설로 ANO1의 current가 기록되지 않는 현상을 설명하기 위하여 ANO1이 실제로 형질막에 발현되어 있는지를 알아본 결과 3가지 두경부암 세포주 모두 형질막 발현이 결핍되어 있었다. 이는 앞의 전기생리학적 결과와 일치하며, ANO1 current가 기록되지 않는 다는 것을 설명할 수 있다. 두경부암 세포에서는 ANO1 단백질 발현은 확인 되었으나, 형질막으로 이동하는 과정이 (membrane trafficking) 이루어지지 않는 것을 추론할 수 있다 (Immunobloting, confocal imaging). 본 연구 결과는 인간 유래 정상 구강 상피세포에서 같은 패턴을 보였다. ANO1의 표면발현과 이온통로 억제제에 대한 암세포 표현형의 변화 일부 연구는 ANO1의 발현량이 증가하게 된다면 세포내 음이온 항상성이 변화하게 되고, 이로 인해 암세포의 생존, 전이 등에 영향을 미칠 것이라고 예상하고 있다. 그러나 ANO1이 세포 표면에 발현되있지 않은것을 관찰 하였기 때문에 본 연구진은 두경부암 세포와 ANO1이 이온통로로서 역할을 하는 세포주의 차이점을 연구해 보았다. ANO1이 표면에 발현되어 있지 않는 세포주와 ANO1이 표면에 발현되어 있는 세포주 에서 ANO1 억제제인 T16A에 대한 cell viability의 비교를 위하여 MTT assay를 통하여 cell proliferation을 측정한 결과, ANO1이 표면에 발현 되어 있지 않는 세포는 억제 효과가 없었으며, ANO1이 표면에 발현 되어 있는 세포는 억제 효과가 있었다. 이와 같은 패턴은 cell migration, cell cycle arrest에서도 동일하게 관찰 되었다. 현재까지 대부분의 ANO1과 암세포의 기능을 고찰한 연구에서 그 상관관계의 원인을 이온통로의 역할을 근거로 설명하고 있지만, 본 연구진은 ANO1이 암세포주의 표현형에 어떤 역할을 주는 지 연구할 때 현재까지 고려하지 않았던 ANO1의 형질막 발현에 대해 고려의 필요성을 제시한다. (출처 : 연구결과 요약문 3p) |
