본 발명은 락토바실러스 속 균종의 동정방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 락토바실러스 속 균종에 특이적인 염기서열을 가지는 하나 이상의 프라이머와 락토바실러스 속 균종에 공통적인 염기서열을 가지는 하나 이상의 프라이머를 이용하여 다중 PCR 방법을 통해 검사체 내의 락토바실러스 속 균종을 검출하고 동정하는 방법에 관한 것이다.본 발명의 프라이머는 락토바실러스 속 균종의 16S rRNA, 23S rRNA 또는 16S rRNA와 23S rRNA 사이 지역의 염기서열을 이용하여 각 균종에 특이적으로 제작한 것으로, 상기 프라이머를 이용하여 검사체 내에 혼재되어 있는 락토바실러스 속 균주를 신속, 정확하게 동정할 수 있어 프로바이오틱 락토바실러스 속 균주를 이용한 건강식품 및 의약품의 원료 개발에 유용하게 사용될 수 있다.